02. Métodos y técnicas de investigación


Ablación experimental

Consiste en destruir una parte del encéfalo y evaluar la conducta subsecuente del animal. En la mayoría de los casos dicha técnica no implica extraer el tejido cerebral, el investigador destruye algo de tejido y lo deja en su sitio.

Evaluación de los efectos comportamentales del daño cerebral

Los experimentos en los que se daña una parte del encéfalo y después se observa la conducta del animal se llaman estudios de lesión. Su fundamento teórico es que la función de un área cerebral puede deducirse basándose en las conductas del animal ya no puede realizar tras haber sido destruída dicha área. Nuestro objetivo es descubrir cuáles son las funciones que cumplen las diferentes regiones cerebrales y luego entender cómo se combinan estas funciones para dar lugar a determinadas conductas. La distinción entre función cerebral y conducta es importante: los circuitos que hay en el encéfalo realizan funciones, no conductas. Cada región desempeña una función que contribuye a la ejecución de la conducta. La interpretación de los datos de los estudios de lesión se complica porque todas las regiones del encéfalo están conectadas entre sí.

Realización de lesiones cerebrales

Las lesiones cerebrales de regiones subcorticales se realizan por lo general haciendo pasar una corriente eléctrica a través de un electrodo. Se guía éste de modo que su extremo llegue al lugar adecuado. El paso de la corriente a través del tejido cerebral produce una alta temperatura que destruye las células cercanas a la región que rodea la punta del electrodo. Las lesiones producidas con este método destruyen todo lo que se encuentra en las cercanías de la punta del electrodo; somas neuronales y axones de neuronas que atraviesan la región.

Un método más selectivo es emplear un aminoácido excitador como el ácido caínico que destruye las neuronas estimulándolas hasta destruirlas. A este tipo de lesiones se les llama lesiones excitotóxicas. Cuando se inyecta a través de una cánula un Aa excitador destruye los somas celulares vecinos, pero no los axones de las diferentes neuronas que pasan por alrededor.

Se dispone incluso, de métodos específicos para marcar y lesionar un tipo determinado de neuronas, los biólogos moleculares han ideado procedimientos para incorporar sustancias químicas tóxicas a los anticuerpos, los cuales se unirán con determinadas proteínas que se encuentran solo en ciertos tipos de neuronas del cerebro. Los anticuerpos alcanzan estas proteínas y las sustancias químicas tóxicas destruyen las células a las que están unidas esas proteínas.

Cuando se producen lesiones subcorticales siempre se causan daños adicionales en el encéfalo.

Inevitablemente se produce un cierto grado de lesión incluso antes de activar el dispositivo de lesión o de iniciar la infusión. No podemos limitarnos a comparar la conducta de los animales lesionados con la de animales de referencia intactos, puede que la causa de alguna de las alteraciones comportamentales sea el daño fortuito de las regiones cerebrales por encima de la lesión. Lo que se hace es una lesión falsa: se hace lo mismo que se haría para producir la lesión, excepto activar el dispositivo de lesión o iniciar la infusión. Este grupo de animales sirve de grupo control: si la conducta de los animales con lesión es diferente de la de los animales control se puede concluir que las lesiones son la causa de las alteraciones comportamentales.

Cirugía Estética

Un aparato estereotáxico consta de un soporte que inmoviliza la cabeza del animal en una posición establecida y un brazo que desplaza el electrodo o la cánula en los tres ejes espaciales a lo largo de distancias cuantificables.

El atlas estereotáxico: no existen dos encéfalos de animales de la misma especie completamente idénticos, pero la semejanza entre los individuos es suficiente para predecir la localización de una estructura cerebral concreta respecto a las características externas de la cabeza. Un atlas estereotáxico incluye fotografías o esquemas que corresponden a secciones frontales, tomadas a diferentes distancias rostrales y caudales a bregma. Cada página del atlas estereotáxico está identificada conforme a la distancia de la sección anterior o posterior respecto a bregma y, la cuadrícula de cada página indica las coordenadas de las estructuras cerebrales en el plano ventral a la parte superior del cráneo y lateral a la línea media.

Así, localizando una estructura neural en una de las páginas se peude determinar su localización respecto a bregma. Por variaciones en la cepa y edad de los animales, la localización que proporcionan los atlas es solo aproximada, siempre hay que probar con una nueva serie de coordenadas, seccionar y teñir el encéfalo del animal, comprobar la localización exacta, corregir los valores y volver a intentarlo.

El instrumento estereotáxico: el dispositivo incluye un soporte para la cabeza, otro para el electrodo y un mecanismo de graduación por el que se mueve éste a lo largo de los tres ejes espaciales: anterior-posterior, dorsal-ventral y lateral-medial.

La cirugía estereotáxica puede usarse para otros fines: los electrodos pueden emplearse tanto para estimular neuronas como para destruirlas y se pueden inyectar fármacos que estimulen neuronas o bloqueen receptores específicos. También hay equipos estereotáxicos para seres humanos.

Por lo general se valen de múltiples puntos de referencia y verifican la localización del electrodo insertado en el encéfalo tomando imágenes de RM o regustrando las actividades de las neuronas en esta región antes de producir la lesión.

Métodos histológicos

Fijación y obtención de cortes: si se quiere estudiar el tejido tal como era en el momento de la muerte del animal, se han de destruir las enzimas autolíticas, o sino éstas convierten al tejido en una masa deforme. También se tiene que evitar que se descomponga por la acción de bacterias o mohos, sumergiéndolo en un fijador (el más frecuente es el formol). Pero antes de ponerlo en una solución fijadora se perfunde. La perfusión supone extraer la sangre y sustituirla con otro líquido. El encéfalo del animal se perfunde porque se obtienen mejores resultados histológicos cuando no hay sangre.

Una vez fijado el encéfalo, se secciona en delgadas láminas y se tiñen diversas estructuras celulares. Las secciones se efectúan con un micrótomo (consta de tres partes: cuchilla, plataforma donde reposa el tejido y un mecanismos que hace avanzar la cuchilla). Las secciones se montan sobre portaobjetos de vidrio, y entonces pueden teñirse sumergiendo el portaobjetos en soluciones químicas. Las secciones teñidas se cubren con un líquido transparente llamado medio de montaje y se coloca un cubreobjetos sobre ellas.

La Tinción: la neuroanatomía microscópica requiere tinciones histológicas específicas. Los investigadores han creado muchas tinciones para identificar sustancias específicas en el interior o exterior de las células. Para verificar la localización de una lesión cerebral se utilizará una de las más simples: la tinción de los somas celulares.

Además del azul de metileno se pueden usar muchos tintes para teñir los somas celulares, el más usado es el violeta de cresilo.

El descubrimiento de las tinciones de somas celulares hizo posible identificar masas nucleares en el encéfalo. La tinción no tiñe selectivamente los somas celulares neuronales: todas las células quedan teñidas por igual. Le corresponde al investigador determinar cuál es cuál, en función de tamaño, forma, y localización.

Microscopia electrónica: para poder ver las estructuras anatómicas tan pequeñas como las vesículas sinápticas y detalles de los orgánulos celulares, los investigadores han de usar un microscopio electrónico de transmisión.

Un microscopio electrónico de barrido proporciona menos amplificación que un microscopio electrónico de transmisión estandar, el cual transmite el haz de electrones a través del tejido. En cambio, muestra los objetos en tres dimensiones.

Microscopio confocal con láser: la microscopia convencional requiere que el tejido se corte en finas secciones, la invención del microscopio confocal con láser permitió ver detalles en el interior de secciones gruesas de tejido o incluso en bloques de tejido. El microscopio confocal requiere que se tiñan con un tinte fluorescente aquellas células o partes de la célula que nos interesan. Si se realizan múltiples exploraciones mientras se mueve la localización de la abertura, se puede obtener un cúmulo de imágenes de secciones a través del tejido.

Marcado de conexiones neurales

Una vez que se sabe que una determinada región del encéfalo interviene en el control de una determinada función cabe preguntarse cuáles son las estructuras que le aportan información y cuáles la reciben de ella.

Marcado de axones eferentes: para marcar éstos se usa un método de marcado anterógrado. Éste método usa sustancias que son captadas por las dendritas o los somas celulares y las transportan a lo largo del axón hasta los botones terminales. En pocos días las células están repletas de moléculas. Entonces se sacrifica al animal, se secciona su encéfalo y se acoplan las secciones sobre portaobjetos. Para poder ver las moléculas se aplica un método inmunocito- químico especial y las preparaciones se examinan al microscopio. (los métodos inmunocitoquímicos sacan provecho de las reacciones inmunitarias).

Los biólogos ponen a punto métodos de producción de anticuerpos para cualquier péptido o proteína. Las moléculas de los anticuerpos están unidas a diferentes tipos de moléculas colorantes, algunos reaccionan con otras sustancias y tiñen el tejido, mientras que otros son fluorescentes: brillan cuando son expuestos a una luz de determinada longitud de onda. Para determinar en qué parte del encéfalo se localiza el péptido o la proteína (Ag), los investigadores sumergen secciones en una solución que contiene colorante y los Ac se unen a su Ag. Cuando el investigador examine las secciones con un microscopio podrá ver cuáles son las partes del encéfalo que contienen el Ag.

Marcado de axones aferentes: para saber cuáles son las regiones del encéfalo que forman parte de los componentes de la “corriente superior” de los circuitos neurales, se ha de determinar cuáles son sus conexiones aferentes. Para hacerlo, se empleará un método de marcado retrógrado. Emplean sustancias que son captadas por los botones terminales y transportadas de vuelta a lo largo de los axones hacia los somas celulares. Días después se sacrifica al animal, se secciona su encéfalo y se examina el tejido bajo una luz de la longitud de onda adecuada.

Los métodos de marcado anterógrado y retrógrado identifican un solo eslabón de una cadena de neuronas, mientras que los métodos de marcado transneural identifican una serie de neuronas que forman conexiones sinápticas en serie una con otra. El método de marcado transneural retrógrado más eficaz emplea un virus de la seudorrabia. Para el anterógrado se usa una variedad del virus del herpes simple.

Cuanto más espere el investigador tras inyectar el virus, mayor será la cantidad de neuronas que lleguen a infectarse. Después de que se haya sacrificado el animal y se haya seccionado su encéfalo, se aplican métodos inmunocitoquímicos para localizar una proteína producida por el virus.

Estudio de la estructura del cerebro humano in vivo

Los recientes avances en las técnicas de rayos X y en la tecnología de los ordenadores han llevado a concebir varios métodos para estudiar la anatomía del cerebro in vivo. Estos avances permiten a los investigadores examinar la localización y extensión de la lesión cerebral mientras el paciente está aún vivo. El primer método que se ideó recibió el nombre de tomografía axial computarizada.

Una radiografía incluso más detallada de lo que hay en el interior de la cabeza de una persona la proporciona una técnica conocida como resonancia magnética (RM). El equipo se parece al del TAC pero no usa rayos X. En su vez, hace pasar un campo magnético muy intenso a través de la cabeza del paciente.

A diferencia de las imágenes de TAC, que se limitan a un plano horizontal, las de RM pueden obtenerse también en plano sagital o frontal. En las imágenes de RM se puede distinguir entre las regiones de sustancia gris y las regiones de sustancia blanca, de modo que pueden verse los principales fascículos de fibras.

Registro y estimulación de la actividad neural

Registro de la actividad neural

Los axones producen potenciales de acción y los botones terminales provocan potenciales postsinápticos en la membrana de las células con las que establecen sinapsis. Estos fenómenos eléctricos pueden registrarse y los cambios en la actividad eléctrica de una región concreta se pueden usar para determinar si dicha región participa en el control de diversas conductas.

Los registros pueden realizarse crónicamente durante un largo periodo de tiempo después de que el animal se haya recuperado de la intervención, o de forma aguda durante un periodo de tiempo relativamente corto en el cual el animal permanece anestesiado. Los registros agudos por lo general se limitan al estudio de las vías sensoriales.

Registro con microelectrodos: los microelectrodos tienen una punta muy fina, lo suficientemente pequeña para poder registrar la actividad eléctrica de neuronas individuales. Por lo general esta técnica se denomina registro de neuronas individuales o de unidades. Los electrodos se implantan en el encéfalo de los animales mediante cirugía estereotáxica, luego se conectan a unos zócalos de conexión eléctrica y se fijan al cráneo con una pasta especial. Cuando el animal se ha recuperado de la cirugía ya se le puede conectar al sistema de registro. Las señales eléctricas que detectan los microelectrodos son bastante débiles y tienen que amplificarse. Los amplificadores usados convierten las débiles señales registradas en el encéfalo en otras más fuertes, pudiendo ser almacenadas en un ordenador para posteriores análisis.

Registro con macroelectrodos: los macroelectrodos no detectan la actividad de neuronas individuales, sino que los registros obtenidos representan los potenciales sinápticos de muchas células del área donde está el electrodo. Los registros representan la actividad de una gran cantidad de neuronas cuyas señales eléctricas atraviesan meninges, cráneo y cuero cabelludo para alcanzar los electrodos.

A veces, se implantan macroelectrodos directamente en el interior del encéfalo humano para detectar el origen de una actividad eléctrica anómala. Esta actividad eléctrica se registra en electrodos pegados al cuero cabelludo y se muestra en un polígrafo.

Estos registros se llaman electroencefalogramas (EEG) o “escritos de la electricidad de la cabeza”.

Pueden utilizarse para el diagnóstico de la epilepsia o para estudiar las fases de sueño y vigilia, las cuales están asociadas con una actividad eléctrica característica. Otra aplicación es supervisar el estado del encéfalo durante una intervención que en principio, puede dañarlo.

Registro de la actividad metabólica y sináptica del cerebro

Las señales eléctricas no son los únicos signos de actividad neural. Si la actividad de una región concreta del encéfalo aumenta, el índice metabólico también lo hace, como consecuencia del mayor funcionamiento de las bombas iónicas de la membrana de las células. Este aumento puede estimularse si inyectamos 2-DG, similar a la glucosa es transportada al interior de las células. Las más activas consumen más glucosa por lo que alcanzan mayor concentración de 2-DG radioactiva.

Pero esta molécula no puede ser metabolizada de modo que quedará dentro de la célula. Más tarde el animal será sacrificado y su encéfalo preparado para la autorradiografía las moléculas de 2-DG se ponen de manifiesto como puntos de gránulos plateados en la emulsión, ya que la radioactividad revela la emulsión como lo haría la luz o los rayos X.

Otro método para identificar las regiones activas del encéfalo se aprovecha de que cuando las neuronas son estimuladas determinados genes del núcleo (genes de expresión temprana) son activados y se producen proteínas específicas. Éstas se unen a los cromosomas del núcleo y la presencia de proteínas nucleares indica que las neuronas han sido activadas.

La actividad metabólica de regiones cerebrales específicas puede asimismo estimarse en el cerebro humano utilizando neuroimagen funcional. El primer método que se inventó fue la tomografía por emisión de positrones (TEP). Al paciente se le inyecta 2-DG radioactiva. Se coloca la cabeza del paciente en un aparato similar al TAC y al descomponerse las moléculas 2-DG emiten partículas llamadas positrones que son detectadas por el TEP.

El ordenador mira cuáles son las regiones del encéfalo que han absorbido 2-DG y crea una imagen de una sección del encéfalo mostrando el nivel de actividad de diversas regiones de ésta sección. Un inconveniente es su coste de funcionamiento ya que las sustancias radioactivas tienen una vida media muy corta (se descomponen y pierden su radioactividad muy rápido). Otro sería que es relativamente baja la resolución espacial de las imágenes.

No obstante, la TEP estima la concentración de determinadas sustancias químicas en diversas partes del encéfalo. El método de neuroimagen con mejor resolución temporal y espacial se conoce como resonancia magnética funcional: permite calcular el metabolismo regional en el encéfalo detectando cambios en el oxígeno de la sangre.

Estimulación de la actividad neural

Estimulación eléctrica y química: la eléctrica implica simplemente pasar una corriente eléctrica por un cable insertado en el encéfalo y la estimulación química se efectúa por lo general inyectando en el encéfalo una pequeña cantidad de un Aa excitador como el ácido caínico o el ácido glutámico. La inyección de sustancias en el encéfalo puede hacerse mediante un dispositivo permanentemente unido al cráneo, de modo que la conducta del animal pueda observarse en repetidas ocasiones. Como el animal tiene libertad de movimientos, se pueden observar los efectos de la inyección en su conducta. El principal inconveniente de la estimulación química es que resulta algo más compleja que la eléctrica, aun así tiene una clara ventaja: activa somas celulares pero no los axones de neuronas que pasen por la región que nos interesa.

Fotoestimulación: existen proteínas fotosensibles cuya acción comienza y termina muy rápido cuando se enciende y apaga una luz de adecuada longitud de onda. Por ejemplo la rodopsina-canal 2 (ChR2) que se encuentra en algas verdes y la NpHT localizada en una bacteria.

Se puede introducir estas proteínas en neuronas incorporando los genes que las codifican al genoma de virus inocuos. Los investigadores necesitan hacer penetrar luz en el cerebro: si las neuronas que expresan las proteínas fotosensibles están en la corteza se puede taladrar un orificio en el cráneo y adherir diodos emisores de luz, pero si las neuronas están en la profundidad del encéfalo se pueden implantar fibras ópticas por cirugía como si fueran electrodos o cánulas. Sus usos clínicos son: como posible tratamiento de la ceguera.

Estimulación magnética transcraneal: pueden emplearse campos magnéticos para estimular neuronas induciendo corrientes eléctricas en el tejido cerebral. En la EMT se usa una bobina electromagnética para estimular las neuronas de la corteza cerebral humana. La bobina de estimulación se pone sobre la parte superior del cráneo de modo que el punto de cruce esté encima de la región que se quiere estimular. La EMT se ha utilizado para tratar síntomas de trastornos como la depresión.

Métodos neuroquímicos

Lo que nos interesa no es la actividad metabólica general de una región del encéfalo sino la localización de neuronas que tengan un tipo específico de receptor o que produzcan un tipo de neurotransmisores.

Detección de neuronas que producen sustancias neuroquímicas específicas

Contamos con tres métodos: los métodos mediante los que se pueden localizar sustancias neuroquímicas específicas (como neurotransmisores y neuromoduladores). Hay tres modos básicos: localizar las sustancias mismas, localizar las enzimas que las sistetizan o localizar el ARN mensajero involucrado en su síntesis.

Los péptidos (o prot) pueden localizarse directamente por medio de métodos inmunocitoquímicos.

Otra forma indirecta de localizar una sustancia es usar “hibridación in situ”: todos los péptidos y proteínas se sintetizan conforme a la información contenida en los cromosomas.

Localización de receptores específicos

La localización de estos receptores puede determinarse siguiendo dos procedimientos diferentes.

En uno de ellos se usa la autorradiografía, se exponen secciones de tejido cerebral a una solución con un ligando radioactivo para un receptor específico. Después se enjuagan las secciones y se usan métodos de autorradiografía para localizar el ligando (y así, a los receptores).

En el segundo procedimiento se aplica la inmunocitoquímica, de modo que los receptores son proteínas y se pueden por tanto, producir Ac frente a ellos. Se exponen las secciones de tejido cerebral al Ac adecuado y se observan al microscopio con una luz de longitud de onda adecuada.

Estimación de las sustancias químicas que segrega el cerebro

Se utiliza cirugía estereotáxica para poner una sonda de microdiálisis en el encéfalo de una rata, de modo que el extremo de la sonda se sitúe en la región que nos interesa. Se bombea una cantidad de una solución parecida al líquido extracelular por una de las cánulas del tubo de diálisis. El líquido atraviesa la segunda cánula de la cual se recoge para analizarlo. A medida que el líquido circula por el tubo va recogiendo moléculas procedentes del líquido extracelular del encéfalo.

En casos excepcionales, se aplica el método de microdiálisis al cerebro humano, pero por razones éticas no es con fines de investigación.

Métodos genéticos

Toda conducta está determinada por interacciones entre el cerebro de un individuo y su entorno.

Muchas características comportamentales parecen “venir de familia”, lo que sugiere que los factores genéticos pueden ser un factor importante en el desarrollo de diferencias fisiológicas que, en última instancia, son responsables de dichas características.

Estudios con gemelos

Un método muy eficaz consiste en comparar el índice de concordancia de este rasgo en pares de gemelos monocigóticos y dicigóticos. Los monocigóticos tienen un genotipo idéntico y por contra la semejanza genética entre dicigóticos es del 50%. Si a ambos gemelos se les ha diagnosticado este trastorno se dice que son concordantes. Si solo uno de ellos ha recibido el diagnóstico se dice que son discordantes. Así pues, si un trastorno tiene una base genética, el porcentaje de gemelos monocigóticos que son concordantes será superior en diagnóstico respecto a gemelos dicigóticos.

En estudios con gemelos se ha encontrado que los factores genéticos influyen en muchas características individuales, entre ellas rasgos de personalidad y una serie de trast individuales.

Estudios sobre adopción

Otro método es comparar personas que fueron adoptadas en una época temprana de la vida, con sus padres biológicos y sus padres adoptivos. Estos estudios requieren que el investigador conozca la identidad de los padres de las personas que se están estudiando y pueda evaluar el rasgo comportamental en los padres biológicos y en los adoptivos. Si los individuos estudiados se parecen notablemente a sus padres biológicos se llega a la conclusión de que el rasgo está influido por factores genéticos. Si en vez de eso, los individuos se parecen a sus padres adoptivos, se concluye que el rasgo está influido por factores ambientales. Por supuesto es posible que intervengan tanto los factores hereditarios como los ambientales, en cuyo caso los individuos estudiados se parecerán tanto a los padres adoptivos como a los padres biológicos.

Mutaciones dirigidas

Las mutaciones dirigidas consisten en genes transformados que se producen en el laboratorio y se insertan en cromosomas de ratones. Estos genes mutados son defectuosos. En muchos casos, el objetivo de la mutación es una enzima que controla una reacción química específica y en otros casos el objetivo es una proteína que por sí misma desempeña una útil función en la célula.

Oligonucleótidos “antisentido”

Este método implica la producción de moléculas que bloquean la producción de proteínas codificadas por determinados genes mediante la inyección de oligonucleótidos “antisentido”. El tipo más frecuente son cadenas modificadas de ADN ó de ARN que se unirán con moléculas específicas de ARN mensajero e impiden que produzcan su proteína. El término “antisentido” hace referencia al hecho de que los oligonucleótidos sintéticos contienen una secuencia de bases complementarias a las que contiene un gen determinado o molécula de ARNm.